Sf9宿主细胞蛋白（HCP）残留检测常见问题分析

湖州申科生物通过自主可控的供应链体系与严格验证的技术性能，确保HCP检测试剂盒的长期稳定供应与优异的分析能力。一方面，公司实现了关键物料的自研自产：校准品采用冻干工艺大规模制备，可稳定保存10年以上；抗体通过大动物免疫获得，产量可满足≥10,000盒试剂盒的生产需求，保障同批次抗体持续供应超过10年；试剂盒经多批次验证显示良好的批内与批间一致性。另一方面，所有产品参考ICH Q2（R2）和ICH M10法规要求完成验证：以E.coli HCP产品为例，其线性范围（243-1 ng/mL）的R²>0.999，各浓度点回收率偏差≤5%；准确度达81.2%-111.6%，中间精密度CV值5.7%-12.4%；LLOQ低至1.5 ng/mL，且对多种宿主细胞（如CHO、HEK293等）的交叉反应均低于检测限。同时，通过二维电泳（检出826个蛋白点）与质谱法（鉴定2204个蛋白点）双重表征校准品，并采用IMBS-2D（>70%）与IMBS-MS（84.7%）正交技术验证抗体覆盖率，从源头确保检测结果的全面性与可靠性。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli )又称大肠杆菌，其作为模式微生物被广泛应用于生命科学研究中。大肠杆菌是表达药用异源蛋白的常用微生物，在被批准的药用蛋白中，大约30%的产品以大肠杆菌作为表达宿主菌。与其他表达平台一样，尽管下游复杂的纯化步骤已经去除了大量的杂质，但终产品中仍会存在HCP残留风险，必须对其进行质量控制，使其符合放行标准。湖州申科生物E.coli表达菌HCP残留检测试剂盒用于大肠杆菌表达菌株BL21来源的宿主细胞蛋白定量检测，适用于重组蛋白类产品的工艺中间品和原液类样品，如白细胞介素（IL）、干扰素（rhIFN）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、肿瘤坏死因子（rhTNF）、促生长因子（EGF/FGF/PDGF）等。试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。

宿主细胞蛋白残留检测抗体覆盖率评估：法规推荐的方法有两大类：一类是传统2D-WB法，另一类是基于抗体亲和的免疫捕获类方法。传统2D-WB法存在需要蛋白变性，样品需要前处理（破坏蛋白天然表位）；转膜效率低；易产生非特异性等缺陷，难以反映真实的覆盖率水平。湖州申科自主开发了免疫磁珠捕获分离技术（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液态性质，可以在悬浮的条件下与HCP样本充分混匀结合，整个过程蛋白无需变性，结合方式与ELISA检测条件相似，可以获得更真实的覆盖率结果。

宿主细胞蛋白（HCPs）是生物制品生产过程中产生的关键工艺相关杂质之一，可导致患者不良的免疫反应、超敏反应，另外也存在导致产品蛋白的降解等问题，影响产品的安全性和有效性，是一项关键质控指标。HCPs残留检测应用常用的方法是ELISA法，操作简单、灵敏度高，通量较高，是HCPs残留检测的日常放行检方法，各国药典规定了用酶联免疫法进行HCPs残留检测。然而，ELISA 方法检测HCP残留仍面临诸多挑战。在实际的工艺生产过程中，宿主来源、生产工艺、纯化方式、生产规模等因素均可能对HCPs的种类及复杂性产生影响。

LC-MS/MS 作为一种成熟可靠的蛋白质组分析技术，凭借其超高的分辨率与准确度在生物分析领域占据重要地位。该技术不仅能实现对低含量宿主细胞残留蛋白（HCP）的定性检测，还可通过建立专属蛋白质谱库准确鉴定 HCP 的具体种类，为深入解析残留蛋白组成提供关键支撑。不过，其应用过程中面临的关键挑战在于，如何优化 LC-MS 方法以满足 GMP 规范中对产品放行检测的严格要求。在质谱检测环节，通过引入表征清晰的内标与外标蛋白，能够准确分析 HCPs 的整体组成，并有效鉴别其中具有潜在风险的高风险蛋白。这一技术手段不仅为开发产品专属的 HCP ELISA 检测方法提供有力数据支持，还能助力工艺优化升级，加速推动生物制品从研发到获批上市的全流程进程。

湖州申科采用免疫磁珠分离（IMBS）结合 2D 电泳或者 LC-MS 的方法评估抗体覆盖率。IMBS主要流程包括多克隆抗体与磁珠偶联，磁珠未结合位点的封闭，HCP样本与结合抗体的磁珠共同孵育，此过程中 HCP 抗体结合可以识别的 HCP，而未识别的 HCP 则通过后续洗涤步骤去除，再通过低 pH等洗脱条件收集抗体捕获的HCP。该方法拥有 AAE(Antibody Affinity Extraction)免疫层析柱分离的所有优点，同时免疫磁珠可以在悬浮的条件下与 HCP样品充分混匀结合，HCP结合效果更佳，由于采用磁珠吸附可以减少 HCP与填料的非特异性吸附，提高实验准确性。