除非纯化的是胞外分泌的蛋白质，否则第一步通常是从细胞或组织中释放出目标蛋白。细胞破碎的方法需根据样本类型选择。对于细菌，常用超声破碎、高压匀质（如French Press）或酶解法（如溶菌酶处理）。对于培养的哺乳动物细胞，通常采用温和的 detergent 裂解液或Dounce匀浆器。植物组织更坚韧，可能需要液氮研磨或专门的酶解方案。破碎后，样品立即变为复杂的浆液，包含细胞膜碎片、细胞器、核酸和所有可溶性蛋白质。此时，必须进行预处理，通常通过差速离心，先低速去除未破碎的细胞和大的碎片，再高速离心（如10,000-100,000 x g）获得含有可溶性蛋白质的上清液（胞质组分）或沉淀（膜组分）。对于膜蛋白，还需加入去垢剂使其增溶。稳定的实验条件是实现蛋白分离纯化的重要保证。河南蛋白分离纯化基础概念
虽然SPR本身不是一种纯化技术，但它在纯化工艺开发，特别是亲和层析的开发和优化中扮演着关键角色。SPR能够实时、无标记地测量生物分子间（如抗原-抗体、受体-配体）的相互作用动力学，即结合速率常数（ka）和解离速率常数（kd），并由此计算亲和力（KD）。在开发免疫亲和层析或其它基于生物特异性相互作用的纯化方法时，SPR可以用于筛选高亲和力的抗体或配体，并优化洗脱条件（如确定能有效解离复合物的pH或竞争剂浓度），从而指导高效亲和纯化策略的设计。硚口区重组蛋白分离纯化细分技术通过反复纯化步骤，可以提高蛋白质样品的纯度。
许多功能性蛋白质是以多亚基复合物的形式存在的。纯化这类复合物的挑战在于保持其组装的完整性和稳定性。策略通常包括：1）共表达所有亚基，以期在细胞内正确组装；2）使用亲和标签标记其中一个亚基，利用该标签纯化整个复合物；3）在整个纯化过程中使用温和的、接近生理条件的缓冲液，以防止复合物解离；4）避免使用强变性剂或剧烈条件；5）使用天然PAGE、SEC或多角度光散射（SEC-MALS）来验证纯化后复合物的组成、化学计量比和完整性。
金属螯合亲和层析（IMAC）是重组蛋白纯化中较常用的亲和技术，利用His标签与二价金属离子（Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺）的特异性结合实现分离。树脂表面偶联亚氨基二乙酸（IDA）或 nitrilotriacetic acid（NTA）基团，可螯合金属离子。His标签通常由6个组氨酸组成，其咪唑环可与金属离子形成配位键。洗脱时通过咪唑竞争结合金属离子，使目标蛋白洗脱。NTA树脂结合能力更强，特异性更高，可有效减少杂蛋白非特异性结合，适用于高纯度蛋白制备。自动化蛋白分离纯化设备提高了实验效率和安全性。
在细胞裂解和纯化初期，内源性的蛋白酶会从细胞器中释放出来，共同作用于目标蛋白，导致其降解。为防止此情况，必须在裂解缓冲液和初始纯化步骤中添加广谱蛋白酶抑制剂 cocktail，其中包括针对丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶的抑制剂。在低温下操作也能有效减缓蛋白酶活性和蛋白降解速率。在大肠杆菌中高水平表达重组蛋白时，常形成不溶性、无活性的蛋白质聚集体——包涵体。纯化包涵体需先通过离心与可溶物分离，再用变性剂（如8M尿素或6M盐酸胍）强烈溶解。较关键的步骤是复性，即通过缓慢去除变性剂（如透析、稀释），使蛋白质在适宜条件下重新折叠成具有正确三维构象的活性分子。此过程复杂且效率多变，是包涵体蛋白制备的主要瓶颈。不同类型的蛋白质需要设计个性化的分离纯化方案。汉南区凝胶过滤层析
色谱技术是一种高效的蛋白分离纯化方法。河南蛋白分离纯化基础概念
现代蛋白质纯化，尤其是对于研究用途的重组蛋白，极大地受益于基因工程技术的应用。通过在目标蛋白的基因序列中引入一段编码特定“标签”的序列，可以在蛋白质的N端或C端融合表达一个额外的多肽或蛋白质。这些标签为后续的纯化、检测或固定化提供了极大的便利。最常见的包括：多聚组氨酸标签（His-tag），用于IMAC纯化；谷胱甘肽S-转移酶标签（GST-tag），用于与固定化谷胱甘肽的亲和层析；麦芽糖结合蛋白标签（MBP-tag），能提高在原核系统中的可溶性；以及FLAG、HA等短肽标签，用于免疫检测和亲和纯化。标签的使用使得无需事先了解目标蛋白的生化性质，就能设计出通用的、高效的纯化方案。河南蛋白分离纯化基础概念
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