北京ELISA法宿主细胞蛋白（HCP）残留检测

为何定制化试剂盒会成为宿主细胞蛋白（HCP）残留检测的优先选择？关键原因与检测准确性、药物安全性紧密关联。HCP ELISA 检测属于多分析物检测技术，其检测结果的准确性，高度依赖校准品品质、抗体质量及检测方法的构建。定制化 HCP ELISA 检测试剂盒的主要优势，在于其依托更具代表性的 HCP 抗原对动物进行免疫，由此制备的 HCP 抗体针对性更突出。这类针对性抗体可大幅降低 HCP 漏检风险，特别是针对生产工艺中特有的高风险 HCP 因子，能呈现更优的检出成效，为药物的安全性、有效性及质量可控性提供坚实保障。

LC-MS技术作为生物制品宿主细胞蛋白（HCP）残留检测的新趋势，应用时需重点考虑以下五方面：①稳定性：需对HCPs的LC-MS检测流程开展验证，全流程需实施严格QC管控，以保障检测结果的一致性与稳定性。②可重复性：不同类型生物制品中HCPs的提取效率存在差异，且不同人员操作会产生偏差，因此需在上机前通过多种方法评估HCPs提取效率，规避人为因素导致的结果重复性不佳问题。③准确度：在方法开发与验证阶段，需设置内标并确定定量算法，通过内标响应回算得出HCPs含量，以此保证定量结果的准确性。④抗干扰能力：高丰度蛋白与特殊基质会干扰质谱检测，需借助前处理手段去除高丰度蛋白或特殊基质，从而降低其对HCPs肽段质谱检测的影响。⑤真实性：样品中除HCPs外的其他物质在质谱分析中也会产生质谱信号，需去除复杂背景噪音以避免假阳性与假阴性情况，同时建立规范的生信分析流程。在分析流程搭建过程中，同样需制定严格的QC标准，并通过后续多种方法验证，明确该标准的真实性。

依据美国药典 1132 章节规定，HCPs 校准品需具备代表性，能够覆盖实际产品生产工艺中的 HCPs。结合 HCP 免疫检测方法的使用目的与预期风险管理需求，为满足工艺开发、验证需求，同时应对下游工艺可能出现的异常失效或工艺变更情况，建议选用上游发酵工艺末端（如澄清处理后的工艺点）的样本作为 HCPs 来源。实际制备时，可采用空细胞或空载细胞，在模拟实际工艺的预设条件下采集样本，再通过二维电泳、高分辨率质谱等蛋白质组学技术，对模拟工艺与实际工艺下 HCPs 的代表性开展表征分析。越靠近下游工艺，HCPs 的蛋白种类越少，虽更接近成品（DS）中的 HCPs，但这类样本可能无法满足工艺开发与验证需求，也难以覆盖工艺潜在风险，因此通常不推荐使用，或只作为上游工艺 HCPs 免疫检测方法的辅助材料。

毕赤酵母（Pichia pastoris）作为第二代酵母表达系统的代表性菌株，已被美国 FDA 认定为 GRAS（一般认为安全）级微生物，具备表达水平高、产物活性优、培养成本低、易于扩大至工业化生产等优势。在生物制药领域，酶制剂、胰岛素、表皮生长因子、胶原蛋白等多款生物制剂，已借助毕赤酵母系统实现商业化生产。和其他产品杂质类似，毕赤酵母宿主残留蛋白（HCP）可能对生物制品的安全性与有效性造成不利影响，故而在生产监测、产品放行等环节中，需对其开展定量研究并实施严格控制。SHENTEK^® 毕赤酵母 HCP 残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法），是湖州申科生物自主研发的毕赤酵母 HCP 通用检测试剂盒，不仅拥有完全自主知识产权，还实现了关键试剂的全国产化。该试剂盒适用于对 GS115、X33 等毕赤酵母菌株生产的生物制品中宿主残留蛋白进行定量检测，具有操作步骤少、检测速度快、专一性强、性能稳定可靠的特点。

湖州申科生物CHO-K1HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法），采用固相酶联免疫吸附法原理，可对CHO-K1细胞生产的生物制品中宿主残留蛋白进行定量检测。检测时，向预包被抗CHO-K1HCPs绵羊多抗的酶标板中，加入校准品或待测样品、HRP标记的抗CHO-K1HCPs绵羊多抗共同孵育。洗涤后加入TMB底物显色，随后用终止液终止酶促反应；再用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，该吸光度与校准品或待测样品中HCPs浓度呈正相关，依据校准品拟合的剂量-反应曲线，即可算出待测样品中HCPs的浓度。该试剂盒对待测样品无需特殊处理，通过合适稀释比例的适用性验证，即可直接使用。且试剂盒操作步骤少、检测快速，同时具备专一性强、性能稳定可靠的特点。

湖州申科运用免疫磁珠分离技术（IMBS），搭配 2D 电泳或 LC-MS 技术评估抗体覆盖率。IMBS 的主要流程涵盖：多克隆抗体与磁珠的偶联反应、磁珠未结合位点的封闭处理、HCP 样本与结合抗体的磁珠共同孵育反应。该过程中，HCP 抗体会结合可识别的 HCP，未被识别的 HCP 则通过后续洗涤步骤去除，随后借助低 pH 等洗脱条件，收集抗体捕获的 HCP。此方法具备 AAE（抗体亲和提取，Antibody Affinity Extraction）免疫层析柱分离的全部优势，同时免疫磁珠可在悬浮状态下与 HCP 样品充分混匀并结合，HCP 结合效果更优；且依托磁珠吸附，能减少 HCP 与填料的非特异性吸附，进一步提升实验准确性。