江西热原检测MAT法

热原检测技术自 20 世纪初问世以来，经历了 “动物试验→体外生化检测→细胞生物学检测” 的三次关键变革，每一次变革均推动检测效率、准确性与全面性的提升。20 世纪初至中期，热原检测方法只有家兔热原试验，通过观察家兔体温变化筛查热原，虽实现了广谱检测，但存在动物成本高、操作繁琐、灵敏度低、种属差异大等局限，难以满足制药行业快速发展需求。20 世纪 60 年代，鲎试验法（LAL 法）的发明开启了热原检测的 “体外生化时代”，利用鲎血变形细胞裂解物的凝血级联反应检测细菌内毒素，灵敏度提升至 ng 级，检测时间缩短至 1-2 小时，迅速成为制药行业常规质控方法；但该方法依赖鲎资源，易受 β- 葡聚糖干扰，且只能检测内毒素，无法覆盖非内毒素热原。21 世纪以来，重组技术与细胞生物学技术的发展推动热原检测进入 “全热原管控时代”：重组级联试剂（rCR）与重组 C 因子试剂（rFC）通过基因工程技术制备，摆脱对鲎资源的依赖，消除葡聚糖干扰，实现标准化生产；单核细胞活化反应测定（MAT）利用人源单核细胞检测全类型热原，填补非内毒素热原检测空白，且结果更贴近人体实际反应。

PyroSHENTEK^®热原检测试剂盒以 “简化流程、提升效率” 为设计理念，采用即用型细胞，冻存细胞无需离心复苏培养，复融后可直接与供试品混合共孵育，大幅节省传统细胞预处理（如调整细胞状态、铺板培养）的时间成本。实验流程清晰可控：只需按要求制备待测供试品与内毒素工作标准品，各取对应体积加入细胞悬液（每孔加样量明确），经 37℃、5% CO₂孵育 24 小时后，离心收集上清并通过 ELISA 法检测 IL-6 含量，全程可在 24 小时内获得稳定可靠的检测结果。这种便捷性尤其适配实验室高通量检测需求，减少人员操作步骤的同时，降低了因复杂操作引入的误差风险，兼顾效率与准确性。

在 MAT 热原检测中，单核细胞系与 PBMC（外周血单个核细胞）的检测结果稳定性差异明显。实验结果数据显示，单核细胞系的标曲 R² 达 1.000，各浓度点 CV 值极低（如 ST1 为 0.92%、ST2 为 1.5%），相对偏差均在 5% 以内；而 PBMC 的标曲 R² 为 0.997，部分浓度点 CV 值超 20%（如 ST2 为 39.6%、ST6 为 45.5%），相对偏差高达 171.43%。这种差异源于两者对热原反应的一致性—单核细胞系能稳定释放 IL-6，PBMC 则因供体差异导致 IL-6 释放水平波动，直接影响热原检测结果的重复性，单核细胞系更适配准确的热原定量需求。

基于单核细胞系的稳定性，MAT 热原检测可将复孔数从药典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®热原检测试剂盒数据显示，单核细胞系标曲的 4 复孔与 3 复孔，各浓度点（0.0125-1.0EU/mL）的准确度（相对偏差）与精密度均在标准范围内，无明显差异。这一调整的主要依据是单核细胞系消除了 PBMC 的异质性，无需依赖多复孔抵消波动，既能满足热原检测的稳定性与统计学合理性要求，又能减少试剂与耗材消耗，降低检测成本，同时提升实验效率。因此样品预测试时可选择3复孔进行初步检测，产品放行还需按照药典要求进行4复孔测试。

单核细胞系培养的高度可控性，为热原检测结果的可靠性提供关键保障。其培养基配方（如营养成分、血清浓度）可定制，确保细胞获取充足营养；培养环境（37℃、5% CO₂、湿度≥90%）可恒定控制，维持细胞好的活性与 TLR 受体表达水平，避免因环境波动导致细胞功能异常。这种可控性还能防止细胞遗传突变与外源污染（如支原体、病毒），确保不同批次单核细胞系的热原响应一致性，让热原检测结果批间差异小，符合 GMP 对检测方法稳定性的要求。

中国药典对 MAT 法热原检测要求 4 复孔，未明确 CV 限值，需结合细胞实验特性合理解读与操作。药典不设 CV 限值的主要原因是：MAT 法基于细胞反应，细胞活性易受环境微小变化（如温度、pH）影响，存在天然不稳定性，过严的 CV 要求可能脱离实际；但实验室可通过积累多批次数据，制定内部 CV 控制范围（如定量上下限 CV≤30%、25%），确保检测重复性。关于 3 复孔的适用性：若长期数据显示 CV 控制良好（如连续 10 批次 CV<20%），且样品为中间过程检测（非 QC 放行），可尝试 3 复孔，但需同步设置加标对照，验证结果可靠性；若为 QC 放行检测，仍建议按 4 复孔操作，符合药典下限要求。对于异常点处理，可采用狄克逊准则（Q 检验）等统计学方法 —— 如某复孔 IL-6 检测值偏离平均值 30% 以上，且无明显操作误差（如加样错误），可判定为异常点并剔除，但需在原始记录中详细说明原因，确保数据可追溯，避免随意剔除导致结果失真。