重庆热原检测体系

MAT 试剂盒热原检测配套细胞的质量控制，是保障检测结果可靠的重要环节，需从功能、安全性、稳定性三方面建立体系。在功能鉴定上，按欧洲 MAT 法要求，需检测细胞的 Toll 样受体（TLR1-TLR9）表达情况—确保细胞能响应不同类型热原（如 TLR4 响应 LPS、TLR2/6 响应脂磷壁酸）；同时考察细胞倍增时间（确保活性稳定）、热原反应性（对标准内毒素和非内毒素热原的信号强度），确保细胞具备热原识别与炎症因子分泌能力。在安全性检测上，需验证细胞无菌（无细菌、真菌污染）、无支原体、无外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝杆菌，避免外源污染影响检测结果。在稳定性考察上，需监测不同代次细胞的热原刺激敏感性，一般要求细胞使用代次不超过 20 代，代次过高会导致 TLR 表达下降、炎症因子分泌减少，影响检测灵敏度。湖州申科的配套细胞还额外通过 Western blot 验证 TLR 受体表达量，并用不同非内毒素热原配体刺激验证响应性，形成全维度质量控制，确保细胞适配热原检测需求。

热原检测MAT法的法规地位持续提升，已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典（EP）是推动 MAT 应用的关键力量：通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验（RPT），且能同时检测内毒素与非内毒素热原；2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法，修订文本将于 2025 年7月1日生效，强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典（USP）<151> 规定，经验证的体外热原试验（如 MAT）可替代家兔法，且需依据 USP<1225>开展验证；FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法，虽暂未替代家兔法，但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型，全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。

MAT法热原检测中，ELISA 加终止液后的读数时间需严格控制，以保障 IL-6 检测信号稳定。湖州申科生物MAT试剂盒说明书明确要求，终止液添加后需在 10 分钟内完成读数，且需避光操作 —— 原因在于，终止液（如硫酸）会终止 TMB 显色反应，但生成的黄色产物在光照下易降解，超过 10 分钟后 OD 值会下降，导致 IL-6 检测值偏低。读数前需进行 30 秒震荡混匀，确保孔内液体浓度均匀，避免因局部浓度差异导致复孔 OD 值波动。酶标仪波长需设置为 450nm，若仪器含 600nm 参考波长，可同时检测 600nm 波长以扣除背景干扰（如细胞碎片导致的光散射），提升检测准确性。需注意的是，读数时不可覆盖封板膜或盖子，避免膜上凝结的水蒸气滴入孔中，导致 OD 值异常升高。若因仪器故障无法及时读数，需将微孔板密封后置于 4℃避光保存，并在 30 分钟内完成读数，同时在记录中注明延迟原因，评估延迟对结果的影响（如延迟 20 分钟，OD 值可能下降 15%，需校正后使用）。

家兔热原试验作为热原检测领域的 “法定传统方法”，被中国药典（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP）均列为法定检测项目，其主要优势在于可通过家兔体温应答筛查所有类型热原，尤其适用于无法排除非内毒素热原污染的高风险产品，如血液制品、放射性质药物及部分生物制剂。然而，家兔热原试验存在明显局限：动物个体差异大，需额外投入时间与成本筛选合格家兔；检测周期长（至少 6 小时），无法满足生物制品快速放行需求；灵敏度较低（对 LPS 检测限≥5EU/kg），与全球倡导的“动物福利3R原则”背道而驰。

PBMC（外周血单个核细胞）的供体差异会直接导致热原检测结果的波动，主要体现在 IL-6 释放水平的不一致。不同供体的 PBMC，其单核细胞比例、TLR 受体表达量、免疫活性状态存在差异：有的供体 PBMC 受热原刺激后， IL-6 释放量高；有的则极低，甚至无明显响应。实验数据显示， PBMC 的标曲各浓度点相对偏差有高达 171.43%的，正是这种差异的体现，导致热原检测结果难以标准化，无法准确判断供试品热原是否超标，从而增加了药品的质量控制风险。