江苏抗体药物内毒素检测方法验证

在进行内毒素检测时，干扰试验又叫增强或抑制试验，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品干扰。在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。药典规定：①当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项品种建立内毒素检查法时，需进行干扰试验；②当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变，或试验环境下发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。生产厂家常发生的一些微小变更，会影响到评估结果，进而影响到供试品对鲎试剂的干扰试验。因此，生产厂家应制定一个重复进行干扰试验的周期，并进行跟踪和记录。

β- 葡聚糖是鲎试剂（LAL）检测内毒素的常见干扰物，可活化 LAL 中的 G 因子通路，导致假阳性结果。干扰多见于含植物源原料的样品（如中药注射剂）、生物发酵产物或环境真菌污染的样品。消除方法包括：使用特异性 LAL 试剂（如添加葡聚糖抑制剂的 LAL），其只对内毒素敏感而不受 β- 葡聚糖影响；采用加热处理（如 80℃加热 10 分钟）破坏 β- 葡聚糖结构；或通过亲和层析去除样品中的 β- 葡聚糖。检测时需设置 β- 葡聚糖阳性对照，若对照反应阳性而内毒素标准品无反应，表明存在干扰，需优化前处理步骤后重新检测。

湖州申科生物动态显色法鲎试剂用于定量测定人用和动物用注射药物、生物制品及医疗器械等样本中的细菌内毒素的含量。 细菌内毒素能特异性地活化反应主剂中的 C 因子，活化的 C 因子活化 B 因子，活化的 B 因子进而活化凝固酶原，凝固酶水解反应中的显色底物，产生游离的pNA（对硝基苯胺）从而引起吸光度变化，根据动态检测溶液吸光度变化率对内毒素进行定量。本品能够快速、高灵敏度地定量检测样品中的内毒素水平，适用于各种实验室和工业生产场景，确保产品质量和安全性。

在內毒素检测的技术体系中，凝胶法与动态显色法基于不同原理与特性，形成互补应用格局。凝胶法依托鲎试剂与内毒素的凝集反应，实现定性或半定量检测，其灵敏度覆盖 0.03EU/ml、0.06EU/ml 等多梯度，60 分钟即可完成反应；检测结果依赖肉眼观察（180° 倒转判读凝胶形成），数据需手工记录，配套 内毒素凝胶法测定仪（恒温仪） 即可开展，虽自动化程度有限，但操作简洁，适用于生产环节的快速初筛。与之相比，动态显色法通过监测反应混合物吸光度或透光率的变化（如达预设检测值的反应时间、信号增速）实现 定量检测 ，灵敏度拓展至 5-0.005EU/ml ，60-90 分钟反应时长虽略长，却可借助酶标仪或全自动内毒素检测分析仪完成全流程自动化操作—软件实时采集数据，契合药品生产质量管理规范（GMP）对数据追溯与精度的要求。二者各有侧重：凝胶法以 “快速定性” 服务基础防控，动态显色法凭 “准确定量 + 自动化” 支撑严苛质控，共同为內毒素检测提供灵活适配的技术路径。

针对单核细胞活化反应测定法（MAT）通过检测内毒素的生物活性，有效规避低内毒素回收（LER）对內毒素检测的影响。其原理是：热原（包括被掩蔽的 LPS）活化单核细胞表面的 TLR 受体，释放 IL-6 等细胞因子，通过 ELISA 检测 IL-6 浓度，结合标准曲线推算热原含量。即使 LPS 因 LER 改变超分子结构，只要仍具生物活性，就能被 MAT 法识别。这种 “检测活性而非结构” 的特性，使 MAT 法成为 LER 场景下内毒素检测的重要补充，与其他方法协同构建高效可靠的热原防控体系。

内毒素检测方法易受样品基质干扰，法规要求在方法应用前必须进行干扰验证，选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度，作为供试品干扰试验种添加的内毒素浓度计算回收率，若回收率在 50%-200% 范围内，表明无明显干扰；若回收率异常，需通过过滤、中和、透析、加热处理等方式优化样品前处理。方法学确认还需涵盖线性范围（如 0.005-5 EU/mL）、精密度（批内 CV≤15%）、检测限（LOD≤0.01 EU/mL）等指标，确保方法在实际样品检测中稳定可靠，符合《美国药典》 <85>、《中国药典》通则 1143 等药典要求。