江苏抗体药物热原检测流程

单核细胞系凭借标准化、可控性等优势，有效解决PBMC（外周血单个核细胞）在热原检测中的局限。其一，单核细胞系源自永生化细胞株（如 Mono-Mac-6），经筛选后细胞特性高度均一，消除供体差异，让热原检测结果稳定性大幅提升。其二，其培养过程可控，培养基配方与环境（温度、CO₂浓度）可准确调控，能维持细胞好的活性，避免 PBMC 因分选、冻存导致的活性衰减。其三，对培养环境波动耐受性更强，可保障细胞遗传稳定且无污染物风险，降低热原检测的操作复杂度与误差率。

随着发热反应分子机制研究的不断深化，单核细胞活化试验（MAT）作为一种体外热原检测技术，愈发受到医药与医疗器械行业的关注并逐步推广应用。该方法的原理是：让人体全血与待检样品中的热原充分接触后，通过检测体系中产生的 IL-1β、IL-6（因稳定性强、重复性优，常作为关键检测指标）、TNF 等促炎细胞因子含量，实现对热原污染程度的评估，整个过程能高度模拟人体先天免疫系统对热原的应答反应。相较于传统热原检测手段，MAT 的优势更为突出：不仅可检出各类热原污染物，包括尚未明确性质的未知热原，以及革兰氏阳性菌（脂磷壁酸）、真菌、病毒等产生的非内毒素热原，填补了传统内毒素检测（如鲎试剂法）的覆盖空白。此外，MAT 无需使用实验动物，契合全球 “替代、减少、优化”（3R 原则）的监管导向，目前已被《欧洲药典》等法规列为家兔热原试验的替代方法，进一步提升了其在合规检测中的适用性。

在单核细胞活化试验（MAT）的热原检测中，IL-6 被确定为关键检测指标，而非 IL-1β 或 TNF-α，主要源于其在稳定性、生物学关联性及商业化应用上的优势。从稳定性来看，IL-6 在体外培养环境中受个体免疫状态影响较小，半衰期更长，实验重复性更优，且检测灵敏度高，能准确定量热原污染水平；而 TNF-α 和 IL-1β 产生时间短、表达量低，还易被蛋白酶降解，导致检测信号波动大，难以标准化。从生物学特性而言，IL-6 是先天免疫反应的炎症介质，可通过活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驱动急性期反应，如诱导大脑产生前列腺素 E2（PGE2）触发发热，与热原的致热机制直接关联，是公认的发热标志物。同时，MAT 法热原检测会辅以 IL-1β 和 TNF-α 监测 ——IL-1β 反映单核细胞活化程度，TNF-α 提示炎症放大效应，形成多因子协同体系。此外，IL-6 的 ELISA 试剂盒市场成熟度高、跨平台兼容性强，而 IL-1β 和 TNF-α 的检测方法在灵敏度和标准化上仍有局限，进一步奠定了 IL-6 的重要地位。

革兰氏阳性菌注射剂产品只依赖内毒素检测存在安全风险，需结合热原检测特性制定防控方案。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分，而革兰氏阳性菌可产生非内毒素热原（NEPs），如脂磷壁酸，这类物质同样能引发人体发热反应，若只检测内毒素，可能遗漏 NEPs 污染，导致临床用药风险。对此，风险评估需重点关注三点：一是建议开展家兔法与内毒素检测的一致性实验，对比两种方法的检测结果，排查是否存在内毒素未检出但家兔法阳性的情况；二是采用 MAT 法热原检测，其通过单核细胞活化机制，可同时识别内毒素与 NEPs，若 MAT 法检测阳性，需进一步追溯 NEPs 来源；三是若无法排除 NEPs 风险，必须按药典要求补充热原检测（如 MAT 法或家兔法），而非只依赖内毒素检测。尤其对于新药或工艺变更后的产品，需通过多方法验证，确保热原检测覆盖所有潜在致热物质，保障临床用药安全。

MAT 法热原检测背景值偏高会干扰结果判读，需从试剂、操作两方面解决。试剂相关问题中，非特异性活化（如试剂含微量热原）会导致细胞异常分泌 IL-6，需选用低内毒素的试剂与耗材；检测试剂添加过多（如抗体浓度过高）会增加非特异性结合，需按说明书稀释试剂或降低推荐浓度。操作环节问题更多见：孔洗涤不充分会残留未结合抗体与酶，需按方案完成规定洗涤次数（如 3-5 次），确保洗涤液充分浸润孔底；洗涤缓冲液污染（如滋生微生物）会引入外源信号，需现配现用缓冲液；加终止液后读板延迟（超 10 分钟），会因黄色产物降解导致背景虚高，需加终止液后立即读板；底物孵育时见光会引发非特异性显色，需在避光环境下进行 TMB 孵育；孔板底部脏（如残留指纹、液体痕迹）会影响光吸收，需用无尘纸清洁孔板底部后再读板。通过以上措施，可有效降低背景值，确保检测信号的真实性，避免因背景干扰导致热原浓度误判。