双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短激发态后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。因其光损伤小、样本透射深等优势，使得观察荧光细胞成为可能。中国医学科学院医学实验动物研究所-双光子显微镜成像平台借助于双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的***成像研究。以小鼠颅内***成像为优势，可动态**观察小鼠颅内神经细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、周细胞、血管、转移瘤细胞、胶质瘤细胞等的变化情况，在**学、神经生物学、发育生物学、神经退行性疾病等领域具有广泛应用。小鼠其它组织脏器，如脾、肺、颅骨、股骨、胸骨等也可借助本平台进行成像研究。双光子显微镜能够进行光裂解、光转染和光损伤等光学操纵。荧光激光双光子显微镜扫描深度
双光子显微镜为什么穿透能力强？因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱，第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性，单光子激发的背景较强，所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱，第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性，单光子激发的背景较强，所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率刚好双光子在这两点具有很大的优势上面的内容基本在谈到双光子优势都会相对说明，在实际操作中成像的深度和样品的关系很大，双光子成像利用高亮度的荧光标记材料，已经有做到mm级别的穿透深度美国荧光双光子显微镜最大分辨率双光子显微镜在组织透明化成像中应用；
双光子显微镜的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是比较高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。
Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).双光子显微镜还可以对一些具有双光子特性的染料细胞进行特定实验；
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；美国激光双光子显微镜商家
在深度组织中以较长时间对细胞成像，双光子显微镜是当前之选。荧光激光双光子显微镜扫描深度
利用钙成像技术记录大脑活动，随着功能光学成像技术的发展，神经学家们已经可以研究脑区和神经元内部的工作情况。功能钙成像技术就是其中之一，其主要原理是将外源性荧光信号和生理现象耦合起来——通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度，以此细胞的功能状态。目前它被广泛应用于实时监测一群相关神经元内钙离子的变化，从而判断其功能活动。该技术的出现使得科学家可以亲眼目睹神经信号在神经网络之中时间和空间上的传递穿梭。荧光激光双光子显微镜扫描深度
