膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路,将微电极前列所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极前列边缘与细胞膜之间形成高阻密封,其阻抗数值可达10~100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。由于此阻值如此之高,故基本上可看成绝缘,其上之电流可看成零,形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。此密封不仅电学上近乎绝缘,在机械上也是较牢固的。又由于玻璃微电极前列管径很小,其下膜面积只约1 μm2,在这么小的面积上离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用。芬兰可升级膜片钳离子电流
离子通道是一种特殊的膜蛋白,它横跨整个膜结构,是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道,当通道开放时。细胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散,从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势,这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电的基础。这些无机离子通过离子通道的进围所产生的电活动是生命活动的基础,只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此,了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义。进口高通量全自动膜片钳产品介绍膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成。
对药物作用机制的研究,在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物,研究它们对通道功能的可能影响,了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用普遍的领域,既有对西药药物机制的探讨,也普遍用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可控制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放,从而减少钙内流,对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。
膜片钳技术与其它技术相结合Neher等**将膜片钳技术与Fura2荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。Neher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,进而可以定量研究钙离子浓度与分泌率的关系及比较大分泌率等指标。他又创膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用的技术。之后又将光电联合检测技术与碳纤电极电化学检测技术首先结合起来。这种结合既能研究分泌机制,又能鉴别分泌物质,还能互相弥补各单种方法的不足。Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用,可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释,从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代∶基因重组技术,膜通道蛋白重建技术。封接是膜片钳记录的关键步骤之一。
膜片钳技术的发展∶全自动膜片钳技术(Automated patch clamp technique)的出现标志着膜片钳技术已经发展到了一个崭新阶段,从这个意义上说,前面所讲的膜片钳技术我们称之为传统膜片钳技术( Traditional patch clamp technique),传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞(或一对细胞),对实验人员来说是一项耗时耗力的工作,不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选,也不适合需要记录火量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题,它不仅通量高,一次能记录几个甚至几十个细胞,而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化,免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率提高了!全自动膜片钳技术采用的标本必须是悬浮细胞,像脑片这类标本无法采用。此外,全自动膜片钳技术只能进行全细胞记录模式、穿孔膜片钳记录模式以及细胞贴附式单通道记录模式,而不能进行其他模式的记录。脂质层电导很低,由于双分子层的结构特点,形成了细胞的膜电容,通道蛋白开闭状况主要决定了膜电导的数值。脑片膜片钳离子电流
玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了重命性的变化。芬兰可升级膜片钳离子电流
在心血管药理研究中的应用,随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为的药物开辟了道路”。创新药物研究与高通量筛选,目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。近几年,分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合,产生了自动化膜片钳等一些新技术。芬兰可升级膜片钳离子电流
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