二代测序——甲基化的作用和检测方法有哪些?
作用
基因表达调控:DNA 甲基化通常与基因沉默有关。例如,在**发生过程中,某些抑*基因的启动子区域(调控基因转录起始的 DNA 序列)可能会发生高甲基化,导致这些基因无法正常表达,从而失去对肿瘤细胞生长的抑制作用。
发育调控:在胚胎发育过程中,DNA 甲基化模式的动态变化对于细胞分化和组织***形成至关重要。不同的细胞类型具有特定的 DNA 甲基化图谱,这些图谱引导细胞向特定的方向分化。
检测方法
亚硫酸盐测序法:这是一种能够精确检测 DNA 甲基化状态的方法。其原理是利用亚硫酸盐处理 DNA,未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则保持不变。经过 PCR 扩增和测序后,可以区分甲基化和未甲基化的位点。 二代测序广泛应用于基因组学研究。长宁区嘉安健达二代测序原理
二代测序—全外显子测序的优势
针对性强:它主要聚焦于基因组中编码蛋白质的区域,这部分区域虽然只占整个基因组的 1 - 2% 左右,但包含了大部分与疾病相关的突变。例如,在研究孟德尔遗传病时,很多致病突变都位于外显子区域,通过全外显子测序可以更高效地找到这些突变。
成本效益高:相比于全基因组测序,全外显子测序的成本相对较低。因为它不需要对整个基因组(包括大量的非编码区域)进行测序,在一定程度上减少了数据量和测序成本,同时又能获取大部分有重要功能意义的遗传信息。 内蒙古哪里有二代测序流程单细胞测序属于二代测序吗?
二代测序的优势和劣势分别有哪些?
优势:能够同时得到大量的序列数据,相比于一代测序技术,通量提高了成千上万倍;单条序列成本非常低廉。
劣势:序列读长较短,Illumina平台为250-300bp,454平台也只有500bp左右;由于建库中利用了PCR富集序列,因此有一些含量较少的序列可能无法被大量扩增,造成一些信息的丢失,且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基。想要得到准确和长度较长的拼接结果,需要测序的覆盖率较高导致结果错误较多和成本增加。
二代测序的应用领域有哪些?
基因组学研究:用于全基因组测序,快速获取物种的基因组序列信息,研究基因组结构、变异、进化等;进行全外显子组测序,重点关注编码蛋白质的外显子区域,发现与疾病相关的基因突变。
转录组学研究:通过对转录组进行测序,可分析基因的表达水平、可变剪接、新转录本发现等,有助于深入了解基因在不同生理和病理状态下的表达调控机制。
疾病诊断与***:在遗传病诊断中,能够检测出导致遗传病的基因突变,为疾病的诊断、遗传咨询和产前诊断提供依据;在**研究中,可分析肿瘤细胞的基因突变、拷贝数变异、基因融合等,为**的早期诊断、靶向***和预后评估提供支持。
药物研发:用于药物靶点的发现和验证,通过分析疾病相关的基因变异和表达变化,确定潜在的药物作用靶点;还可进行药物基因组学研究,预测患者对药物的反应和不良反应,实现个体化药物***。
微生物学研究:对微生物群落进行宏基因组测序,无需培养即可分析微生物的种类、丰度和功能基因,了解微生物群落的结构和动态变化,研究微生物与宿主的相互作用,以及在环境科学、农业、医学等领域的应用
一代、二代、三代测序的区别是什么?
二代测序——甲基化的定义和概念
定义:甲基化(methylation)是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。在生物系统中,这是一种常见的化学修饰方式,主要涉及在DNA、RNA和蛋白质等生物大分子上添加甲基基团。
DNA甲基化
概念及位置:DNA甲基化主要是在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的作用下,将甲基基团添加到DNA分子中的特定碱基上,最常见的是在CpG岛(富含CpG二核苷酸的区域,CpG是指胞嘧啶-鸟嘌呤的碱基对)的胞嘧啶(C)的5’碳位上添加甲基。 二代测序的优势是高灵敏度。西藏哪里有二代测序公司
二代测序是一种能够同时对数百万甚至数十个亿DNA片段进行测序的方法。长宁区嘉安健达二代测序原理
二代测序的建库步骤③
三、末端修复和加A尾(以DNA文库为例)
末端修复:经过片段化后的DNA末端可能是不平齐的,有5'-突出端或3'-突出端。末端修复反应可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶,将这些末端补平,使其成为平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,在合适的反应缓冲液和dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)存在下,可以将突出的末端补平。
加A尾:在末端修复后的平末端DNA分子的3'-末端加上一个A碱基。这一步是为了后续连接带有T-突出端的接头做准备,一般使用Klenow片段(3'→5'外切酶活性缺失)在dATP存在下进行加A反应,这样可以使DNA片段能够高效地与带有T-突出端的测序接头连接。 长宁区嘉安健达二代测序原理
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