双光子显微镜的优势相比普通的显微镜电子显微镜可以观察尺度更小的东西，冷冻电镜更是可以观察有活性的生物大分子，而双光子显微镜有什么优势呢？它能做到什么普通光学显微镜做不到的事情吗？原来，双光子显微镜可以精确穿透较厚标本进行定点、观察！由于电磁波的波长越短，粒子性越强，受散射影响也就越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光，在增加了激光的穿透性的同时还减少了对细胞的毒性。除此之外，因为只有物镜焦点处能发生双光子激发效应，所以扫描的精确度极高，也能提高激发光效率，减少被扫描点之外的荧光物质消耗。于双光子激发需要两个光子同时到达，因此只有在焦点附近的样品区域才会激发，从而实现三维成像和高分辨率。国外investigator双光子显微镜厂家有哪些
双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。国外荧光双光子显微镜原理双光子显微镜可以在小鼠的的任何部位进行有生命体成像。
有了双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜可以发挥更好的作用。那么，什么是双光子激发技术呢？在光子密度较高的情况下，荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子，使电子跃迁到更高的能级。短时间后，电子跳回到较低的能级，发出波长为长波长一半的光子(P=h/λ)。利用这个原理，双光子激发技术诞生了。双光子显微镜使用长波长脉冲激光通过物镜会聚。由于双光子激发需要很高的光子密度，物镜焦点处的光子密度比较高，所以双光子激发只能发生在焦点处产生荧光，该点产生的荧光穿过物镜，被光学探头接收，从而达到逐点扫描的效果。
第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。在一批“早鸟项目”中，该系统已被多个研究组应用于不同的模式动物和行为范式，如小鼠的社交新颖性识别、斑胸草雀受调控后大脑特定神经元变化、新型神经递质乙酰胆碱探针的传导适应性分析以及猕猴三脑区成像等多项研究。双光子显微镜的应用中，该如何选择以及更好的使用PMT。
要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。双光子显微镜角膜成像。美国激光双光子显微镜的原理
双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；国外investigator双光子显微镜厂家有哪些
双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例；生物领域：贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域：美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点，避免了层与层之间的互相干扰，较大地提高了数据储存密度。双光子显微镜已延伸到各个领域研究中，它能对样品进行三维观察，其基础双光子激发效应也具有极高的应用价值。我们可以相信，随着科技不断发展，其他技术的不断结合，双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。国外investigator双光子显微镜厂家有哪些
