多光子激发在紫外成像的优势在可见光脉冲中能得到紫外衍射的显微观察像。即使不使用紫外域光源、光学元件用可见光源、光学元件就能得到紫外光激励的高空间分辨率图像。多光子在生物成像中的优势在生物显微镜观察方面,较早考虑的是不损坏生物本身的活性状态,维持水分、离子浓度、氧和养分的流通。在光观察场合,无论是热还是光子能量方面都必须停留在细胞不受损伤的照射量、光能量内。多光子显微镜则能够满足此,而且还具有很多优点。如三维分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往激光显微镜不具备,或具有无法比拟的超越特性。多光子显微镜作为神经科学重要的研究工具,近年来发展快速,品牌也众多。Ultima 2P Plus多光子显微镜多光子激发
2020年,JianglaiWu等人提出提高2PM横向扫描速率的装置,称为FACED(free-spaceangular-chirp-enhanceddelay)。圆柱透镜将激光束一维聚焦,会聚角为Δθ。光束进入到一对几乎平行的高反射镜中,其间距为S,偏角为α。经过反射镜多次反射后,激光脉冲被分成多个传播方向不同的子脉冲(N=Δθ/α),脉冲间以2S/c的时间延迟(c,光速)回射。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光,这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器,通过FACED模块可产生80个脉冲焦点,其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像,虚拟源越远,物镜处的光束尺寸越大,焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜,从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm,y轴的横向分辨率为0.35µm。美国多光子显微镜方案双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。
光学成像技术与分子生物学技术的结合为研究上述科学问题提供了条件与可能。因此,在现代分子生物学技术基础上,急需发展新的成像技术。在动物体内,如何实现基因表达及蛋白质之间相五作用的实时在体成像监测是当前迫切需要解决的重大科学技术问题。这是也生物学、信息科学(光学)和基础临床医学等学科共同感兴趣的重大问题。对这-一一科学问题的研究不仅有助于阐明生命活动的基本规律、认识疾病的发展规律,而且对创新药物研究、药物疗效评价以及发展疾病早期诊断技术等产生重大影响。
因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 双光子显微镜的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度,为了不损伤细胞,双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有 100 飞秒,而其周期可以达到 80至100兆赫兹。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时,物镜的焦点处的光子密度是比较高的,双光子激发只发生在物镜的焦点上,所以双光子显微镜不需要共聚焦***,提高了荧光检测效率。多光子显微镜将生物打印结构准确定位和定向到特定的解剖部位,使其能够在小鼠组织内制造复杂结构。
多光子激发扫描显微成像系统的不足。只能对荧光成像。如果样品包括能够吸收激发光的色团,如色素,样品可能受到热损伤。分辨率略有降低,虽然可以通过同时利用共焦的小孔得到改善,但是信号会有损耗。受昂贵的超快激光器限制,多光子扫描显微镜的成本较高。多光子激发显微镜应用举例。动物和脑片神经细胞结构与功能、动物脑皮层的成像、胚胎发育过程的长时间动态观测、多光子激发光解笼、细胞内微区钙动力学、多光子激发自发荧光、其它应用。多光子显微镜技术是对完整组织进行深层荧光成像的优先技术。美国飞秒激光多光子显微镜方案
目前中国显微镜中如多光子显微镜、共聚焦扫描和电子显微镜等。Ultima 2P Plus多光子显微镜多光子激发
对两个远距离(相距大于1-2 mm)的成像部位,通常使用两条单独的路径进行成像;对于相邻区域,通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题,这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰;时空复用方法指的是同时使用多个激发光束,每个光束的脉冲在时间上延迟,这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像,但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加,从而限制了区分信号源的能力;并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求;大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比,这会容易导致组织损伤。Ultima 2P Plus多光子显微镜多光子激发